Hemaglutinación Indirecta
La hemaglutinación indirecta constituye una técnica diagnóstica fundamental que emplea hematíes o eritrocitos (de origen humano o animal) como partículas marcadoras en lugar de soportes inertes como el látex. En esta técnica, los hematíes son sensibilizados con antígenos que no le son propios naturalmente, constituyendo una diferencia fundamental respecto a la hemaglutinación directa (empleada, por ejemplo, en la determinación de grupos sanguíneos), donde los antígenos son componentes naturales de la membrana eritrocitaria.
Protocolo
1. Preparación de Materiales y Reactivos
Placa de Microtitulación (Microwell Plate): Placa de fondo en "U" o "V", de 96 pocillos.
Reactivo de Eritrocitos Sensibilizados: Glóbulos rojos (generalmente de carnero o sintéticos) que han sido recubiertos químicamente con el antígeno específico.
Diluyente: Solución salina tamponada (ej., PBS) o solución amortiguadora específica, generalmente con proteínas (ej., albúmina bovina al 1% o suero inactivado) para estabilizar los glóbulos rojos y minimizar la aglutinación inespecífica.
Suero Problema: Muestra de suero del paciente (previamente inactivado por calor si es necesario, para destruir el complemento).
Controles: Suero control positivo y suero control negativo.
Material de Medición: Micropipetas de volumen variable y puntas estériles.
2. Procedimiento de Titulación (Diluciones Seriadas)
El objetivo es realizar diluciones progresivamente mayores del suero del paciente para determinar el título de anticuerpos.
A. Preparación de la Placa
Dispensar Diluyente: Añadir el volumen requerido de diluyente (ej., 25 μL o 50 μL) a todos los pocillos de una fila (excepto el primer pocillo, que a veces recibe la muestra sin diluir o una dilución inicial más baja).
Preparación de la Dilución Inicial:
Añadir el mismo volumen de suero problema (ej., 25 μL o 50 μL) al primer pocillo. La dilución inicial suele ser 1:2 si se añade a un volumen igual de diluyente.
Repetir esto para el control positivo y el control negativo en filas separadas.
Realización de Diluciones al Doble:
Tomar el volumen de muestra del primer pocillo (ej., 25 μL) y transferirlo al segundo pocillo.
Mezclar suavemente por pipeteo.
Tomar el mismo volumen del segundo pocillo y transferirlo al tercer pocillo.
Continuar esta transferencia seriada hasta el último pocillo de la fila.
Descartar el volumen del último pocillo para mantener el volumen constante en el resto.
B. Adición del Reactivo
Adicionar Eritrocitos Sensibilizados: A cada pocillo de la placa (que ahora contienen las diluciones del suero y los controles), añadir el volumen especificado (ej., 25 μL o 50 μL) de la suspensión de eritrocitos sensibilizados (generalmente una suspensión al 0.5%-1%).
3. Incubación y Sedimentación
Mezcla: Golpear suavemente la placa para asegurar una mezcla uniforme.
Incubación: Incubar la placa a temperatura ambiente (generalmente 20ºC a 25ºC) en una superficie sin vibraciones.
El tiempo de incubación crítico es de 1 a 2 horas, permitiendo que la gravedad sedimente los eritrocitos.
4. Lectura de Resultados
Después de la sedimentación, la forma en que los eritrocitos se depositan en el fondo del pocillo determina el resultado.
Interpretación de resultados
La aparición de un velo rosáceo que cubre uniformemente el pocillo constituye un resultado positivo, indicando que los hematíes han sido agregados por los anticuerpos específicos presentes en el suero. En contraste, la presencia de un anillo o botón de color rojo localizado en el fondo del pocillo se interpreta como negativo, reflejando que los hematíes, al no existir anticuerpos específicos que los agreguen, sedimentan por gravedad en el fondo de la cavidad tras la incubación.
Controles esenciales
Estas técnicas requieren obligatoriamente la utilización de un control negativo para descartar la presencia de anticuerpos naturales (hemaglutininas) preexistentes en el suero problema. En el pocillo destinado al control negativo se deposita el suero problema sin sensibilizar, adicionando hematíes no sensibilizados. Si se obtiene un resultado positivo en este control negativo, ello indicaría la presencia de hemaglutininas naturales que aglutinan los eritrocitos no específicamente. En tal circunstancia, cualquier positividad obtenida con hematíes sensibilizados carecería de valor diagnóstico, pues no sería posible discriminar si la aglutinación se debe a la reacción antígeno-anticuerpo específica buscada o únicamente a la acción de estas hemaglutininas preexistentes. Ante esta situación, es imprescindible repetir la determinación, preincubando previamente el suero problema con hematíes no sensibilizados para adsorber y eliminar las hemaglutininas circulantes que interfieren en la reacción.